细胞内蛋白质结构和功能的研究

1. 研究背景

众所周知，细胞内是一个非常复杂和拥挤的环境，细菌和哺乳动物细胞内生物大分子的浓度分别可以达到300-400 g/L和50-250 g/L，占据了细胞内体积的~30% - 40%（图 1）。由于细胞环境复杂，目前在胞内进行蛋白质结构表征的研究难度很大。传统的晶体衍射、冷冻电镜、核磁共振技术（NMR）和荧光等技术已经在蛋白质研究中发挥了巨大作用，但主要在离体条件下进行的。荧光方法能用于细胞内蛋白质的研究，但是分辨率较差。相对而言，细胞内NMR是一种无损的非侵入性技术，能够在原子水平上提供组成、结构、相互作用和动态性过程的定量信息，是理想的活细胞内蛋白质结构和动态性研究工具，因此NMR在细胞原位环境开展蛋白质结构和功能研究已成为国内外重要的研究方向。

图 1. 哺乳动物细胞（A）和细菌（B-C）的生物分子模型图

2. 代表性研究成果

1）细胞内蛋白质折叠和解折叠动态性机制解析

该研究工作以IgG结合蛋白质GB3的两个突变体MutX 和 MutY（图2）为研究体系，采用核磁共振技术，对其在细胞内的折叠态与解折叠态之间的构象交换进行了表征。结果表明蛋白在细胞内和缓冲溶液中的折叠和解折叠的动力学过程有较大差异（图2），折叠态、解折叠态和过渡态的相对自由能受到了细胞环境的影响（图3）。进一步研究表明，这一影响主要来自于细胞内的五级作用力，但这种作用力不足以改变蛋白质的折叠态和解折叠态的构象。该研究结果也表明离体条件下的蛋白质功能研究需要在细胞环境中进行独立验证。相关研究发表于Journal of the American Chemical Society杂志上（J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 11363−11366，Top 1区IF: 15.42）。审稿人认为“这项工作是一个非常有趣的新发现，并认为该工作是一个具有潜在重要影响的新发现”。( https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.9b04435 )

图2. GB3突变体 MutX和MutY在细胞内和水溶液的折叠与解折叠构象交换动力学的比较。

图3. GB3突变体 MutX和MutY在不同条件下的自由能图。

2）细胞内蛋白质静电相互作用的直接测量

静电相互作用在许多重要生物反应过程中起到至关重要的作用，如酶催化、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA/RNA相互作用和H+的转移等生物反应。但绝大多数蛋白质都是在细胞中执行其功能，复杂细胞环境可以扰动蛋白质的静电相互作用，这对蛋白质功能的实施非常重要，但这种扰动能达到何种程度目前尚不清楚。

该代表性工作主要应用核磁共振技术和双突变循环的(double mutational cycle，DMC)方法，测量了细胞内IgG结合蛋白质GB3中的8对电荷相互作用，并与在胞外条件测量的结果进行比较。结果表明，蛋白质GB3中5对电荷的静电相互作用没有发生明显变化，另外3对电荷的静电相互作用减弱了70%以上（图4）。进一步的研究表明，细胞内蛋白质静电相互作用强弱与蛋白质折叠转移自由能有关，折叠态和解折叠态的转移自由能都影响细胞内蛋白质静电相互作用，尽管后者通常比前者的影响更大（图5）。研究结果凸显了在细胞内直接研究蛋白质相互作用和蛋白质功能的重要性。该工作发表于JACS杂志上（J. Am. Chem. Soc., 2021, 143, 19606−19613，Top 1区IF: 15.42），并被该期刊选为亮点文章。审稿人认为这项工作“很不错且具有创新性，并认为该研究结果对生化和生物界的学者来说，都具有潜在的广泛兴趣”。(https://doi.org/10.1021/jacs.1c10154)

图4. 在胞外条件和细胞内测量的GB3电荷对之间静电相互作用的相关性。

图5. 蛋白质折叠转移自由能（ΔGtr）的性质：A) 所有测量的GB3突变体的折叠转移自由能; B)和C)分别为折叠转移自由能和折叠态相对转移自由能及解折叠态相对转移自由能之间的相关性。

3. 未来研究计划

中共中央和中共山东省省委制定的“十四五”规划纲要都明确提出“把保障人民健康放在优先发展的战略位置，包括面向人民生命健康加快科技创新驱动发展”。所以未来我们的研究方向除了延续模式蛋白质在大肠杆菌体系的弱相互作用和动态性的研究之外；另一个重点研究的方向，将在现有工作的基础之上，拓展研究功能蛋白质在哺乳动物细胞体系上的性质、功能和药物筛选的研究。